Selasa, 09 Juni 2015

IMUNOHISTOKIMIA




IMUNOHISTOKIMIA


         Pemeriksaan imunohistokimia dapat memberi informasi mengenai kandungan berbagai unsur molekul didalam sel normal maupun sel neoplastik. Dasar dari pemeriksaan ini adalah pengikatan antigen (yang terkandung dalam sel) dengan antibodi spesifiknya yang diberi label chromogen. Teknik ini diawali dengan prosedur histoteknik yaitu prosedur pembuatan irisan jaringan (histologi) untuk diamati di bawah mikroskop. Irisan jaringan yang didapat kemudian memasuki prosedur imunohistokimia. (1,2)
         Interaksi antara antigen dan antibodi adalah reaksi yang tidak kasat mata. Oleh karena itu, diperlukan visualisasi adanya ikatan tersebut dengan molekul antibodi yang digunakan dengan enzim atau fluorokrom. Enzim (yang dipakai untuk molekul) selanjutnya direaksikan dengan substrat chromogen (yaitu substrat yang menghasilkan produk akhir berwarna dan tidak larut) yang dapat diamati dengan mikroskop bright fiekl (mikroskop bidang terang). Imunohistokimia yang menggunakan fluorokrom untuk molekul antibodi, dapat langsung diamati dibawah mikroskop fluorescence. (2)
         Berbagai jenis molekul yang yang terkandung dalam sel dapat dideteksi dengan teknik ini, termasuk berbagai jenis reseptor, onkoprotein, faktor pertumbuhan dan protein-protein lainnya. Dengan ditemukannya teknik ini maka berbagai pemahaman-pemahaman baru di bidang penyakit, termasuk onkologi, menjadi semakin baik sehingga telah membawa dunia kedokteran kepada era yang baru. (1)
         Imunohistokimia menjadi teknik pilihan untuk menentukan petanda-petanda biologik tersebut karena relatif mudah, murah dan dapat diterapkan pada sediaan rutin histopatologik. Namun demikian perlu diperhatikan sejumlah faktor yang dapat mempengaruhi hasil pemeriksaan, dimana pengaruh faktor-faktor tersebut dimulai dari tahap pembedahan, pengolahan jaringan hingga penilaian hasil pulasan. (1,2)
         Untuk dapat menagani penderita secara lebih sempurna, seyogyanya pemeriksaan ini dijadikan pemeriksaan rutin bagi setiap penderita kanker. (1)



Antigen dan Antibodi
         Antibodi dibentuk oleh sistem imun dari spesies asing akibat masuknya bahan kimia spesifik kedalam spesies ini. Sistem imun mempunyai kemampuan alami yang dibawa lahir untuk mengenali tiap ikatan asam amino, karbohidrat, atau lemak serta bereaksi terhadap bahan-bahan tersebut. Pengenalan ini tergantung dari besarnya molekul. (3)
         Diperlukan molekul yang besarnya beberapa Dalton agar reseptor mengenal dan sistem imun bereaksi. Molekul ini disebut antigen. Banyak protein yang cukup besar untuk merangsang terjadinya respons imun, yang dengan demikian bersifat antigenik. Namun banyak juga molekul-molekul lain, atau protein-protein kecil yang tidak bersifat antigenik dan harus terlebih dahulu berikatan dengan molekul yang lebih besar agar dapat dikenal oleh sistem imun. Bahan kimia atau protein dengan molekul kecil ini disebut hapten. (3,4)
         Bila molekul asing (foreign) masuk kedalam tubuh, maka ia akan dikenali sebagai bahan yang terikat dengan reseptor Human Leukocyte Antigen (HLA) tertentu pada makrofag. Makrofag mencerna molekul asing tersebut dan menampilkan ikatan tertentu dari kelompok luar atom yang disebut epitop pada permukaan dari makrofag. Epitop tersebut kemudian kontak dengan limfosit T helper, yang menolong menampilkan epitop tersebut pada limfosit sel B. Sel B akan mensintesa rantai protein immunoglobulin yang mampu mengikat epitop secara spesifik. (3,4)
         Tiap bahan antigenik mempunyai banyak tempat (site) epitop, juga disebut determinan, yang mampu berikatan dengan antibodi. Secara in vivo, respons terhadap antigen dapat bersifat luas dan antibodi yang bereaksi dengan determinan-determinan pada antigen ini disebut antibodi poliklonal. (3) 

Metode Pewarnaan Imunohistokimia
         Prinsip dari metode imunohistokimia adalah perpaduan antara reaksi imunologi dan kimiawi, dimana reaksi imunologi ditandai adanya reaksi antara antigen dengan antibodi, dan reaksi kimiawi ditandai adanya reaksi antara enzim dengan substrat. (5)
         Pemeriksaan imunohistokimia dimaksudkan untuk mengenali bahan spesifik tertentu didalam jaringan dengan menggunakan antibodi dan sistem deteksi yang memungkinkan untuk mengenali bahan spesifik tersebut secara visual. (5)
         Dengan diketahuinya bahan spesifik tersebut maka dokter dapat menentukan dengan lebih tepat histogenesis dari lesi tertentu dan prognostiknya.
         Antibodi bereaksi terhadap determinan dari antigen yang berada dalam bahan spesifik yang diperiksa. Antibodi-antibodi ini akan berikatan dengan bahan dalam jaringan, dan antibodi-antibodi ini diketahui dengan menggunakan antibodi-antibodi lain yang dirancang untuk mengenal immunoglobulin tersebut dari spesies-spesies yang terekspos dengan bahan asli (original). (5)
         Antibodi-antbodi penentu (anti-antibodi dari spesies lain) ini ditempeli (tagged) dengan beberapa molekul pelapor (reporter molecule) misalnya fluorecein atau enzim yang dapat mengkatalisa reaksi selanjutnya menuju produk yang dapat dilihat.
         Sistem deteksi Avidin-biotin complex (ABC) menggunakan spesimen jaringan tertanam dalam paraffin, dengan ketebalan 5 mikron.
         Antibodi spesifik terhadap bahan spesifik yang diperiksa dikombinasi dengan antigen . Antibodi ini ditentukan dengan anti-antibodi yang dihasilkan oleh spesies lain yang mengenal antibodi pertama sebagai antigen. Anti-antibodi (antibodi sekunder) ini mempunyai molekul biotin yang lekat padanya, memungkinkan deteksi lanjut dengan protein avidin.
         Biotin adalah vitamin yang relatif kecil. Ikatannya dengan rantai immunoglobulin tidak berpengaruh dengan kemampuannya untuk mengenal antibodi primer.
         Avidin adalah protein yang afinitasnya sangat kuat terhadap molekul biotin. Kombinasi kedua zat ini irreversible.
Tiap molekul avidin mempunyai 4 tempat (site) kombinasi dengan biotin. Dan tiap molekul biotin mempunyai dua tempat kombinasi dengan avidin.
         Molekul Horse Radish Peroxidase (HRP) adalah molekul reporter.  Enzim ini diikat oleh biotin dan berpadu didalam complex avidin-biotin sedemikian rupa sehingga bila HRP ini berdekatan dengan anti-antibodi terbiotinil sekunder (secondary biotinylated anti-antibody), complex tersebut berikatan dengan tempat ikatan biotin pada satu dari molekul avidin. Hal ini membuat enzim pada tempat asli dari interaksi antibodi primer-antigen.
         Kemudian enzim tersebut bereaksi dengan hydrogen peroxidase. Hal ini menimbulkan transfer elektron-elektron dari senyawa chromogen yang mengendap (precipitates) sebagai pigmen yang tidak larut (insoluble).
         Chromogen yang digunakan adalah 3,3’-diaminobenzidine tetrahydrochloride (DAB). Molekul ini didalam larutan dalam konsentrasi terlarut, tidak berwarna dan mengendap berupa massa coklat gelap bila teroksidasi. Endapan ini tidak larut dalam alcohol. Hal ini memungkinkan seksion diconterstained dengan hematoxylin, didehidrasi dengan ethanol, dan dicleared dengan xylene dan ditutup dengan coverslip.  (5)     
         Untuk menjaga spesifisitas reaksi ini hendaknya harus menggunakan antibodi monoklonal yang memiliki idiotipe dan isotipe yang sama. Salah satu teknologi yang digunakan untuk memproduksi antibodi monoklonal adalah teknologi hibridoma. (2,3,5)
         Antibodi monoklonal inilah kemudian diproduksi secara masal dan dapat digunakan untuk mendeteksi suatu marker yang diekspresikan oleh sel pada permukaannya maupun yang dilepaskan oleh sel ke cairan tubuh. Untuk menentukan marker yang di ekspresikan ke permukaan sel. Maka metode pengukurannya menggunakan metode imunohistokimia (imunositokimia), sedangkan yang dilepaskan pada cairan tubuh dapat menggunakan metode imunosuspensi seperti : ELISA (Enzyme-linked Immunosorbent Assay), RIA (Radioimmunoassay) dan sebagainya.(3,5,8,9)
         Bila hewan coba atau individu di imunisasi dengan suatu antigen secara berulang, maka di dalam tubuh hewan coba atau individu tersebut akan terjadi suatu respons imun yang dapat menghasilkan antibodi. Antigen yang di imunisasikan kedalam tubuh hewan coba atau individu tersebut, pertama kali akan dijamu oleh suatu sel yang disebut sebagai APC (Antigen Presenting Cell). Selanjutnya  didalam tubuh, APC antigen tersebut diproses dan diekspresikan bersama MHC Kelas II (Mayor Histocompatibility Complex II). Terekspresinya MHC Kelas II pada permukaan sel tersebut, kemudian dikenal oleh limfosit yaitu limfosit – Th (T helper). Adanya pengenalan dari MHC tersebut kemudian APC mensekresikan suatu mediator yang disebut sebagai interleukin (IL) antara lain IL-1 dan Il-12. Kedua IL ini akan mempengaruhi limfosit Th mengalami diferensiasi menjadi Th-1 dan Th-2. IL-1 yang dihasilkan oleh APC akan memicu aktifitas Th-1, sehingga Th-1 aktif ini akan menghasilkan beberapa mediator antara lain IL-2, IFNγ dan TNFβ. IFNγ dan TNFβ  akan memicu peningkatan aktifitas APC. Sedangkan IL-2 dan IFNγ akan mengaktifasi limfosit (Th-2). Th-2 aktif akan menghasilkan beberapa mediator seperti IL-4, IL-5, IL_6. Ketiga mediator ini akan mempengaruhi limfosit B mengalami diferensiasi menjadi sel memori dan sel plasma yang menghasilkan antibodi. Adapun proses pembentukan sel plasma didalam kelenjar limfoid sekunder seperti pada limpa atau kelenjar getah bening dapat melalui beberapa tahap yaitu mulai dari sentroblas berkembang menjadi sentrosit, kemudian menjadi plasmablas dan berakhir menjadi plasmasit (sel plasma) yang menghasilkan antibodi. Oleh karena ada beberapa limfosit B didalam tubuh hewan coba atau individu yang tersensitisasi antigen, maka masing-masing limfosit B tersebut akan membentuk klon-klon tersendiri yang memungkinkan akan membentuk antibodi yang memiliki isotope dan idiotipe yang berbeda. Campuran antibodi inilah yang dikenal dengan antibodi poliklonal. Untuk memproduksi antibodi monoklonal secara masal dapat dilakukan dengan memanfaatkan teknologi hibridoma. (3,5,6)    

Pewarnaan imunohistokimia pada dasarnya ada dua macam metode yaitu : (5,8,9)
  1. Metode direct
  2. Metode indirect


  1. Metode Direct
Pada metode ini antibody monoclonal yang digunakan untuk mendeteksi suatu marker pada sel, langsung di label dengan suatu enzim. Adapun cara pewarnaannya adalah sebagai berikut :
Persiapan reagen :
H2O2  3% (digunakan untuk menghilangkan aktifitas endogenous peroksidase).
Trypsin 0,025% dalam PBS (digunakan untuk membersihkan debris protein yang      kemungkinan menutup epitope dari bahan yang akan dideteksi).
Larutan kerja DAB (digunakan sebagai indicator warna pada reaksi enzimatik).
R/  Aquadestilata                    1 ml
      Buffer substrat H2O2       50 tetes
      Larutan DAB stok                        1 tetes

Cara kerja :
Lakukan deparafinisasi, caranya adalah dengan memasukkan sayatan jaringan berturut-turut kedalam :
1.      xylol : 2 menit
2.      xylol : 2 menit
3.      etanol absolute : 1 Menit
4.      etanol absolute : 1 menit
5.      etanol 95% : 1 menit
6.      etanol 95% : 1 menit
7.      etanol 80% : 1 menit
8.      etanol 70% : 1 menit
9.      air mengalir : 10-15 menit
10.  Masukkan kedalam larutan H2O2 30% : 30 menit
11.  Cuci dengan PBS 3 kali (a : 2 menit)
12.  Trypsin 0,025% selama 6 menit pada 370C
13.  Cuci dengan PBS (a : 2 menit)
14.  Masukkan kedalam antibodi monoklonal dilabel enzim (misalnya untuk mendeteksi IgG pada mencit, maka monoklonal antibodi yang dilabel dengan enzim adalah IgG anti mencit) : 30 menit
15.  Cuci dengan PBS 3 kali (a : 2 menit)
16.  Masukkan kedalam substrat kromogen : 5 menit
17.  Cuci dengan PBS 3 kali (a : 2 menit)
18.  Cuci dengan aquadestilata
19.  Masukkan ke dalam Mayer’s Haematoksilin : 6 menit
20.  Cuci dengan air mengalir, sampai bersih
21.  Dehidrasi – Clearing – Mounting




The direct method of immunohistochemical staining uses one labelled antibody, which binds directly to the antigen being stained for. (8)
b. Metode Indirect
    Pada metode imunohistokimia indirect, antibodi monoklonal yang digunakan untuk mendeteksi suatu marker pada sel, tidak dilabel dengan suatu enzim. Antibodi ini dikenal dengan sebutan antibodi primer. Namun pada metode ini bukan berarti tidak membutuhkan antibody yang dilabel enzim. Hal ini tetap dibutuhkan tetapi yang dilabel adalah antiimunoglobulin, dalam imunohistokimia indirect dikenal dengan sebutan antibodi sekunder. Untuk melabel antibodi sekunder dapat dilakukan secara langsung ataupun tidak langsung. Secara langsung artinya antibodi sekunder telah terlabel oleh suatu enzim. Sedangkan secara tidak langsung artinya pelabelan antibody sekunder dengan suatu enzim adalah menggunakan suatu bahan perantara (kombinasi) seperti : biotin-streptavidin atau biotin-avidin.
Adapun caranya adalah sebagai berikut :
Persiapan reagen :
H2O2 3%
Trypsin 0,025% dalam PBS
Larutan kerja DAB
R/  Aquadestilata                    1 ml
     Buffer substrat H2O2        50 tetes
     Larutan DAB stok             1 tetes

Cara kerja :
Lakukan deparafinisasi, caranya adalah dengan memasukkan sayatan jaringan berturut-turut kedalam :
1.      xylol : 2 menit
2.      xylol : 2 menit
3.      etanol absolute : 1 menit
4.      etanol absolute : 1 menit
5.      etanol 95% : 1 menit
6.      etanol 95% : 1 menit
7.      etanol 80% : 1 menit
8.      etanol 70% : 1 menit
9.      air mengalir : 10-15 menit
10.  Masukkan kedalam larutan H2O2 3% : 30 menit
11.  Cuci dengan PBS 3 kali (a : 2 menit)
12.  Trypsin 0,025% selama 6 menit pada 370C
13.  Cuci dengan PBS 3 kali (a : 2 menit)
14.  Masukkan  kedalam  monoclonal  antibodi / antibodi primer. Apabila ingin
      mendeteksi    IgG  pada  mencit,  maka  antibodi  primer  yang   digunakan  
      adalah IgG anti mencit (misalnya rat anti mous = 1:5) : 30 menit
15.  Cuci dengan PBS 3 kali (a: 2 menit)
16.  Masukkan  kedalam  sekunder antibodi (oleh karena primer antibodi yang
      digunakan  pada  tulisan  ini menggunakan rat anti mous,   maka sekunder
      antibodi  yang  digunakan  dapat  berupa rabbit anti rat peroksidase label) :
      30 menit.
17.  Cuci dengan PBS 3 kali (a: 2 menit)
18.  Masukkan kedalam substrat kromogen : 5 menit
19.  Cuci   dengan   PBS   3    kali  ( a :  2   menit ),  kemudian  dibilas  dengan
      aquadestilata
20.  Masukkan kedalam Mayer’s Hematoxylin : 6 menit
21.  Cuci dengan air mengalir
22.  Dehidrasi – Clearing - Mounting

The indirect method of immunohistochemical staining uses one antibody against the antigen being probed for, and a second, labelled, antibody against the first. (8)
Metode Combine Indirect
Persiapan reagen :
H2O2 3 %
Trypsin 0,02% dalam PBS
Larutan kerja DAB

R/  Aquadestilata                    1 ml
     Buffer substrat H2O2        50 tetes
     Larutan DAB stok
Cara kerja :
Lakukan deparafinisasi, caranya adalah dengan memasukkan sayatan jaringan berturut-turut kedalam :
1.      xylol : 2 menit
2.      xylol : 2 menit
3.      etanol absolute : 1 menit
4.      etanol absolute : 1 menit
5.      etanol 95% : 1 menit
6.      etanol 95% : 1 menit
7.      etanol 80% : 1 menit
8.      etanol 70% : 1 menit
9.      air mengalir : 10-15 menit
10.  Masukkan kedalam larutan H2O2 3% : 30 menit
11.  Cuci dengan PBS 3 kali (a : 2 menit)
12.  Trypsin 0,025% selama 6 menit pada 370C
13.  Cuci dengan PBS 3 kali (a : 2 menit)
14.  Masukkan ke dalam monklonal antibodi/antibodi primer. Apabila ingin mendeteksi IgG pada mencit, maka antibodi primer yang digunakan adalah IgG anti mencit (misalnya rat anti mous = 1:50) : 30 menit
15.  Cuci dengan PBS 3 kali (a : 2 menit)
16.  Masukkan kedalam sekunder antibodi (oleh karena contoh tulisan ini menggunakan primer antibodi berupa rat anti mous, maka antibodi sekunder yang digunakan dapat berupa rabbit anti rat biotinilated label) : 30 menit
17.  Cuci dengan PBS 3 kali (a : 2 menit)
18.  Masukkan kedalam streptavidin/avidin HRP label : 30 menit
19.  Cuci dengan PBS 3 kali (a: 2 menit)
20.  Masukkan kedalam substrat kromogen : 5 menit
21.  Cuci dengan PBS 3 kali (a : 2 menit), kemudian bilas dengan aquadestilata
22.  Masukkan kedalam Mayer’sHematoxylin : 6 menit
23.  Cuci dengan air mengalir
24.  Dehidrasi – Clearing – Mounting


Masalah-Masalah Dalam Teknik Imunohistokimia (1)
*      Faktor-faktor pra analisis
         Pemeriksaan ini merupakan pemeriksaan yang relative mudah dan murah. Keuntungan lain dari teknik ini adalah dapat diterapkan pada sediaan rutin yang diterima pada laboratorium histopatologi dan dapat dilakukan secara retrospektif pada sediaan-sediaan arsip.
         Namun demikian, untuk mendapatkan hasil yang dapat dipercaya hasilnya, sejumlah persyaratan harus dipenuhi. Fiksasi sangat penting peranannya, karena teknik ini bertumpu pada reaktifitas antigen dalam sel. Fiksasi yang suboptimal dapat menurunkan bahkan meniadakan reaktifitas antigen, sehingga memberikan sinyal yang lemah atau negative palsu. Secara umum, proses fiksasi jaringan harus dilakukan sesegera mungkin tanpa penundaan dan dilakukan dengan sempurna. Fiksasi yang dianjurkan adalah da;am formalin berdapar fosfat 10%. Waktu fiksasi bervariasi antara 6 hingga 24 jam dan dalam keadaan terendam scara merata. Jika jaringan tumor berukuran besar, maka harus dilakukan sayatan-sayatan parallel menyerupai “toast rack” berjarak 1 cm untuk menjamin paparan cairan formalin yang merata, dan jumlah cairan fiksatif minimal 5-10 kali volume jaringan.
         Selanjutnya, pengolahan jaringan harus dilakukan secara sempurna tahap demi tahap melalui alcohol yang bertingkat kadarnya dan impregnasi dalam paraffin dengan titik leleh maksimum 600C. Pengolahan jaringan yang tidak sempurna dapat menghambat proses pulasan karena jaringan yang tidak homogen dalam paraffin mudah terlepas dari kaca benda. Mudahnya jaringan terlepas dari kaca benda disebabkan karena pada proses pulasan, dilakukan prosedur “antigen retrieval” yaitu pemaparan terhadap gelombang elektromagnetik atau pemanasan; serta pemaparan dengan larutan-larutan yang keras sifatnya, dimana tahapan-tahapan ini tidak dilakukan pada prosedur pulasan hematoksilin eosin yang rutin.

*      “Quality control” dan “Quality assurance”
         Berbagai faktor menyebabkan perbedaan hasil pemeriksaan, antara lain jenis antibody, metode “antigen retrieval”, factor-faktor preanalitik dan interpretasi hasil. Untuk menekan perbedaan ini dianjurkan melakukan “quality control” dan “quality assurance”.

*      Nilai cut off
         Walupun sedikit, variasi dalam penggunaan nilai cut off masih dilaporkan. Namun demikian, pada berbagai penelitian, untuk berbagai petanda lazimnya digunakan nilai cut off 10%.

*      Tempat pemeriksaan
         Teknik ini relative mudah dalam arti prosedurnya sederhana, namun diperlukan kecermatan yang tinggi dalam pelaksanaannya pada setiap  tahap. Di United State Kingdom, dianggap bahwa laboratorium yang ideal adalah yang melakukan tes minimal 250 kasus dalam 1 tahun. Laboratorium lokal yang ingin melakukan tes ini sangat dianjurkan untuk melakukan “quality assurance”.


DAFTAR PUSTAKA

  1. Hardjolukito, Endang SR. The 8th Course and Workshop, Basic Science In Oncology, Modul A, Putaran Ke-3. Jakarta, 19 - 21 Mei 2005.
  2. Immnunohistochemistry. Available at : http://www.google.com/Immunohistochemistry/lecture 15b.pdf
  3. Ulrika V. Mikel, editor,Gary L. Bratthauer and Lila R.Adams. Advanced Laboratory Methods in Histology and Pathology. Armed Forces Institute of Pathology, American Registry of Pathology, Washington DC, 1994, p.3-40.
  4. Abbas, Abul K et al. Cellular and Molecular Immunology, Second Edition, W.B Saunders Company, 1994, p 47 – 49.
  5. Sudiana, I Ketut. Teknologi Ilmu Jaringan dan Imunohistokimia. Jakarta, Sagung Seto, 2005, hal. 36 – 47.
  6. Rosai J Editor. Rosai and Ackermans. Surgical Pathology, Ninth Edition. Volume 1. Philadelphia, Mosby, 2004, p. 34 – 45.
  7. Monoclonal Antibody. Available at : http://encarta.msn.com/media/images.
  8.  Immunohistochemistry. Available at : http://en.wikipedia.org/wiki/immunohistochemistry.htm.
  9. Introduction Immunohistochemistry. Available at : http://www.ihcworld.com/introduction.htm.
  10.  Methods and Technique for Histologist and Immunohistochemists. Available at : http://www.ihcworld.com/protocol database.htm.












 











































































































Diposting oleh di

2 komentar:

  1. Unknown28 November 2020 pukul 05.54

    Terimakasih kakk atas ilmunya yang telah dibagikan, semoga makin berkah..

    BalasHapus
  2. Sumarni Angkasa29 Juni 2021 pukul 09.35

    Kami Punya Komunitas pemainayam.org Yang Cukup Ramai..

    Kirim Kontak kak, Untuk Pembelian..

    BalasHapus

Langganan: Posting Komentar (Atom)