IMPRINT DAN FROZEN SECTION

IMPRINT DAN FROZEN SECTION

I. FROZEN SECTION

A. Pendahuluan ^1,2

Metode pemeriksaan frozen section yang dilakukan di labaratorium saat ini berdasar pada uraian  Dr. Louis B. Wilson pada tahun 1905. Wilson mengembangkan teknik ini pertama sekali atas permintaan Dr. William Mayo, seorang ahli bedah dan salah satu  pendiri Mayo Klinik. Sebelumnya pernah dilaporankan oleh Dr. Thomas Cullen pada Rumah Sakit   Johns Hopkins  di  Baltimore yang menggunakan metode frozen section tetapi hanya  memakai formalin sebagai media fiksasi. Seorang ahli patologi Dr. William Welch, juga pada Rumah Sakit Johns Hopkins, mengadakan percobaan dengan prosedur Cullen's tetapi tidak memiliki makna klinis. Oleh karena itu, Dr. Louis B. Wilson dianggap sebagai pelopor Metode Frozen Section.

Frozen section merupakan metode pengelolaan jaringan dengan tidak memakai proses dehidrasi, clearing dan embedding. Frozen section merupakan teknik pemeriksaan histologi, tetapi kemudian digunakan untuk melihat substansi jaringan dan untuk mendiagnosa penyakit pada biopsi jaringan pada kasus-kasus darurat. Prosedur standar dapat menimbulkan efek yang mengganggu dalam melihat unsur-unsur jaringan yang diperiksa (Banccroft & Cook 1994). Peningkatan teknik frozen section belakangan ini menghasilkan perkembangan yang cepat pada bidang histokimia dan imunohistokimia.

B. Definisi ²

Frozen section adalah teknik pengelolaan jaringan dengan cara membekukan dengan cepat (quenching) suatu jaringan segar pada suhu -160ºC, dan berikutnya  memindahkan molekul air  (di dalam es) dengan proses sublimasi pada ruang vakum dengan suhu yang lebih tinggi lagi, misalnya -40ºC. Kemudian blok diletakkan pada suhu ruangan  dan difiksasi dengan uap air atau embedding di dalam medium yang sesuai. 

C. Aplikasi Frozen Section  ^2,3

       Frozen section  memiliki banyak aplikasi yang dapat digunakan dalam pemeriksaan histopatologi, antara lain :

• Mendiagnosa keganasan pada durante operasi (on-table)
• Digunakan pada diagnosa dan penelitian enzim histokimia dimana enzim bersifat labil
• Digunakan pada metode immunofluorescent
• Digunakan pada metode immunohistokimia
• Digunakan pada diagnosa dan penelitian non-enzim histokimia, misalnya lemak dan karbohidrat
• Digunakan pada beberapa metode di dalam neuropatologi

D. Metode Frozen Section ³

Untuk menghasilkan hasil yang baik, ketebalan pemotongan pada cryostat merupakan salah satu syarat yang harus dipenuhi. Jaringan harus dalam keadaan baik. Kualitas terbaik pada teknik cryostat section dihasilkan dari jaringan tanpa fiksasi, dengan membekukan segera oleh salah satu teknik di bawah ini. Kondisi di dalam cryostat harus optimal, meliputi:

• Temperatur blok harus tepat sebelum jaringan dipotong
• Kerja microtome harus baik
• Penyesuaian anti-roll plate harus tepat

Jaringan yang akan dibekukan harus dalam keadaan segar dan secepat mungkin dibekukan. Apabila pembekuannya lambat  dapat menyebabkan distorsi dan akan terbentuk artefak kristal es pada jaringan. Metode frozen section pada umumnya menggunakan:

·         Nitrogen cair                                                                                  (-190ºC)

·         Isopentane yg didinginkan dengan nitrogen cair                          (-150ºC)

·         Karbondioksida ’cardice’                                                                (-70ºC)

·         Gas karbondioksi                                                                            (-70ºC)

·         Aerosol spray                                                                                  (-50ºC)

Penggunaan gas cair dalam keadaan normal sudah dibatasi pada teknik histokimia. Kelompok gas yang banyak digunakan adalah nitrogen cair. Keuntungannya yaitu dapat membekukan dengan cepat dan lebih dapat diterima penggunaannya oleh banyak pihak. Sedangkan kerugiannya adalah pada jaringan lunak dapat menyebabkan terbentuknya kristal es yang cepat dan luas pada jaringan.

E. Ketebalan jaringan ⁵

Ketebalan jaringan yang dianjurkan untuk teknik frozen section adalah 6 (enam) mikron. Pada ketebalan ini zat warna akan diserap dengan  baik dan sediaan akan mudah untuk dibaca sehingga ahli patologi akan dapat mengumpulkan banyak informasi. Pemotongan yang lebih tipis akan menyebabkan pewarnaan yang pucat karena zat warna kurang terserap dan akan banyak bagian yang tidak dapat dibaca.

Meskipun demikian ketebalan enam mikron akan lebih banyak membutuhkan waktu untuk pengeringan artefak.  Tetapi akan mengurangi lubang pada inti sel yang berasal dari artefak kristal es.

Ketebalan harus diperhatikan secara visual. Berikut ini akan ditunjukkan gambaran Lung Adenocarcinoma dan Uterine Sarcoma dengan ketebalan pemotongan  6 micron dan 3 micron.

Biasanya ketebalan yang dikehendaki tidak dapat langsung diperoleh, akan tetapi harus dilakukan berulang-ulang sampai diperoleh ketebalan yang dikehendaki.

 Perubahan temperatur pada blok yang telah diambil akan menyebabkan  perubahan suhu menjadi lebih hangat dan jaringan akan mengembang. Oleh karena itu jaringan dipotong sedikit lebih tipis dari yang diperlukan sehingga ketika mengembang akan didapat ketebalan jaringan yang diinginkan.

F. Metode Pewarnaan ^2,3,5

Metode pewarnaan yang paling sering digunakan adalah Hematoxylin yang dikombinasikan dengan Eosin. Prosedur pewarnaan sama seperti metode lainnya yang memakan waktu 1-2 menit. Pewarnaan yang lebih cepat adalah Methylen Polychromatic Blue yang membutuhkan waktu 1-2 detik. Setelah jaringan diletakkan diatas 4-5 slide kemudian tetesi dengan Methylen Blue 4% dan segera celupkan ke dalam air dan larutan glukosa 5%.

Prusedur pewarnaannya dengan menggunakan pewarnaan Hematoxylin Eosin (HE) adalah sebagai berikut :

1. Fiksasi jaringan dengan formol-acetic alcohol selama 20 detik
2. Bilas dengan air bersih
3. Beri pewarnaan Harris’s hematoxylin selama 1,5 menit
4. Bilas dengan cairan lithium carbonate, alcaline tap water atau Scott’s tap water
5. Bilas dengan air bersih
6. Beri perwarnaan Eosin selama 10 detik
7. Bilas dengan air bersih
8. Keringkan dan tutup dengan deckglass

Kita juga dapat menggunakan teknik frozen section ini dengan pewarnaan Periodic Acid Schiff (PAS)  untuk memperlihatkan sel-sel yang memproduksi mucin. Khususnya adanya Signet Ring Cell ( pada kasus peritoneal metastasis atau untuk menentukan batas reseksi pada kanker  lambung). Kemudian slide  frozen section dimasukkan ke dalam mikrowave 600 W , lalu ambil slide tersebut dan tambahkan 1% zat warna PAS. Setelah itu dikembalikan ke dalam mirowave selama 10-15 detik. Kemudian dibilas lagi dengan  air dan tempatkan ke dalam suatu cuvette dan masukkan ke dalam mikcrowave selama  10-15 detik. Terakhir dibilas lagi dengan air.

 PAS  bernilai positif apabila jaringan tampak berwarna sedikit kemerahan. Apabila dilakukan pewarnaan counterstain dengan methylen blue dapat selesai dalam waktu 30 detik.

G. Prosedur Frozen Section ^{1, 2, 6}

Prosedur frozen section dapat dibagi dalam empat tahap, yaitu :

·                                             Quenching (freezing)

·                                             Drying

·                                             Fixation and embedding

·                                             Subsequent treatment

Quenching

 Tahap ini merupakan tahap menghentikan reaksi kimia dan difusi di dalam jaringan. Proses ini menyebabkan air di dalam jaringan akan berubah menjadi kristal es. Dan tahap berikutnya jaringan akan masuk ke dalam fase drying.

Drying

Bagian ini merupakan teknik selanjutnya yang akan lebih banyak memakan waktu, dimana jaringan mengandung 70-80% air dan akan menghilangkannya tanpa merusak jaringan tersebut. Drying dapat dibagi menjadi 3 (tiga) tahap, yaitu :

• Masuknya panas ke jaringan  yang menyebabkan proses sublimasi
• Perpindahan uap air dari kristal es yang melalui bagian yang kering dari jaringan
• Kembalinya uap air ke permukaan jaringan

H. Kelebihan Frozen Section ²

Teknik frozen section jarang digunakan dalam pemeriksaan patologi rutin, meskipun memiliki aplikasi pada teknik imunohistokimia. Teknik ini banyak memiliki kelebihan yang dapat meminimalisasi :

·                                 Kehilangan substansi terlarut

·                                 Perubahan letak bagian-bagian sel

·                                 Perubahan zat kimia yang reaktrif

·                                 Denaturasi protein

·                                 Kehancuran dan inaktivasi enzim

I. Keterbatasan Frozen Section ⁴

Dalam Bab VII buku Surgical Pathology Ackerman's, disebutkan bahwa frozen section merupakan salah satu prosedur yang penting tetapi sulit dilakukan oleh seorang ahli patologi karena memerlukan pengetahuan dan pengalaman yang cukup.

Dalam Manual Surgical Pathology pada bagian yang berjudul" Frozen Section Not Permanent Section”  disebutkan  ada  empat  keterbatasan,  yaitu:  keterbatasan waktu  , keterbatasan pewarnaan khusus, ketiadaan konsultasi dan terbentuknya artefak kristal es.

    1. Keterbatasan waktu

Teknik frozen section harus dilakukan dengan cepat untuk mendapatkan diagnosa yang cepat pula. Hal-hal yang perlu dilakukan agar tidak terjadi kesalahan  dalam mendiagnosa atau membaca hasil frozen section adalah: percayaan diri, ketrampilan yang cukup, dan menjalin hubungan baik dengan rekan kerja ahli bedah. Jika seorang ahli patologi memiliki keterampilan dan pengalaman dalam frozen section, waktu yang dibutuhkan untuk mengambil jaringan, mewarnai dan membaca slide tidaklah lama, hanya beberapa menit saja.

Ahli patologi yang berpengalaman dalam potong makros, proses ini dapat dilakukan dalam 10 menit. Dan beberapa menit lebih lama untuk jaringan yang sulit.

    2. Keterbatasan pewarnaan  khusus

Pada saat ini dapat disebut malpraktek apabila mendiagnosa lymphoma, sarcoma dan semua kanker yang memiliki gambaran yang mirip dengannya tanpa pewarnaan immunoperoxidase untuk melihat ekspresi gen. Barangkali di masa depan kita akan memiliki  studi yang lebih cepat dengan menggunakan teknik frozen section. Namun untuk sekarang ini masih banyak dijumpai keterbatasan.

    3.  Ketiadaan konsultasi

Ketika melakukan pemeriksaan, seorang ahli patologi sendirian di dalam ruangan frozen section dengan hanya ditemani buku untuk membantu pekerjaannya. Di negara maju, mereka dapat melakukan konsultasi dengan sejawatnya selama operasi berlangsung. Saat ini sistem telepatologi sudah dapat digunakan untuk mendiagnosa suatu penyakit khususnya di rumah sakit yang jauh letaknya dari pusat pendidikan. Apa yang dahulu merupakan teknologi yang lamban dan terbatas, saat ini telah berkembang menjadi teknologi yang efektif yang menjadi sarana konsultasi.   

Diperkirakan di masa depan kita akan melihat bahwa teknologi telepatologi menjadi sarana konsultasi patologi intraoperasi yang rutin digunakan.

    4. Terbentuknya artefak kristal es

Sudah merupakan sifat kimiawi air, bahwa air akan memperluas  pembekuan dalam pembentukan ikatan hidrogen. Oleh karena itulah es akan mengapung. Seperti pada umumnya artefak dalam ilmu patologi, kita dapat mengenali artefak yang berada di sekitar objek yang hendak kita periksa sehingga kita tetap dapat membaca slide dengan benar.

    a. Tekanan artefak

Jaringan akan tertekan oleh perluasan gelembung es. Berikut ini adalah gambaran parenkhim ginjal sebagai contoh yang nyata dari  fenomena tersebut. Gambar yang di sebelah kiri adalah gambaran parenkhim ginjal yang tertekan oleh kristal es. Gambar sebelah kanan adalah jaringan yang sama tanpa menggunakan teknik frozen section.

b. Perubahan chromatin inti sel

Gambaran berikut ini merupakan kekurangan frozen section dimana akan terjadi perubahan gambaran chromatin inti sel. Gambar sebelah kiri adalah contoh gambaran  chromatin dalam jaringan frozen section. Tampak citoplasma bervacuol dan dijumpai adanya artefak kristal es. Pada gambar sebelah kanan chromatin tampak padat dan hyperchromatin dibandingkan frozen section.

J. Interpretasi Frozen Section ³

Seperti telah disebutkan di atas, indikasi  utama frozen section adalah untuk mendiagnosa suatu keganasan dan menentukan batas reseksi pada saat pembedahan.

Membaca gambaran mikroskopik bukan merupakan bagian  yang paling sulit pada teknik frozen section. Diagnosa mikroskopik yang tepat merupakan hal yang paling penting. Akan terlihat gambaran yang khas di bawah mikroskop. Dianjurkan pengambilan jaringan dan teknik frozen section ini dilakukan oleh seorang ahli patologi yang berpengalaman. Jika dilakukan oleh seorang ahli patologi yang tidak berpengalaman akan dapat menyebabkan kesalahan dalam mendiagnosa suatu penyakit.

II. TEKNIK IMPRINT ⁷

Banyak studi yang mempelajari teknik imprint  dan dapat kita temui di beberapa literatur. Kebanyakan praktisi setuju bahwa teknik imprint ini merupakan  teknik tambahan untuk metode frozen section yang memberikan informasi tambahan yang sangat berharga. Lebih dari itu, mungkin juga dapat digunakan untuk melihat gambaran jaringan jika teknik frozen section tidak memadai untuk pemeriksaan jaringan tersebut. Imprint biasa digunakan untuk pemeriksaan  patologi kelenjar getah bening dan spleen. Moore and Reagen, Mouriquand and Dargent, Triebe, Pilar and Rubenstone telah memakai teknik imprint ini untuk mendeteksi tumor payudara.

Teknik  imprint ini  digunakan untuk mengidentifikasi Pneumocystis carinii Paru-paru  dan  Scleroderma dengan menggunakan metode fluorescent antibodi. Teknik ini sangat dianjurkan untuk rutin digunakan pada biopsi operasi kecil dan biopsi untuk spesimen tulang sebab apabila lambat dalam prosesnya akan menyebabkan terjadinya proses decalsifikasi.

Metode enzim bisa sangat efektif dengan  menggunakan teknik imprint. Metode enzim untuk menggambarkan berbagai macam tumor sangat efektif digunakan. Metode alkalin fosfatase biasa digunakan untuk tumor-tumor tulang.

Prosedur Imprint ⁷

Kualitas imprint sangat tergantung dari teknik yang digunakan. Secara umum metode yang dipakai oleh Tribe untuk biopsi payudara  dapat digunakan untuk hampir semua jenis jaringan dengan sedikit modifikasi, dengan tahap-tahap sebagai berikut :

       1. Ambil jaringan yang diperlukan untuk teknik frozen section ataupun parafin blok

       2. Potong jaringan tersebut dengan diameter sekitar setengah inchi. Tepi harus rata dan tidak boleh ada lemak yang menonjol keluar karena dapat mengganggu gambaran sitologi.

       3. Tekan permukaan potongan  dengan kuat ke arah slide. Jika jaringan berupa cairan atau darah maka imprint harus dibuat dengan hati-hati dan terlebih dahulu disaring dengan menggunakan  kertas saring. Kemudian buatlah 3 atau 5 imprint. Dan buatlah dua dari tiga imprint tadi dengan tekanan yang lebih kuat untuk mencegah hypocellularasitas yang biasa terjadi pada kasus-kasus seperti sclerosing adenosis dan scirrhous carcinoma.

       4. Fiksasi jaringan dengan alkohol 95% kemudian jaringan dikeringkan.  Bila akan menggunakan teknik enzim maka jaringan jangan difiksasi dengan alkohol.

       5. Warnai jaringan dengan pewarnaan Papanicolaou untuk semua imprint dan menggunakan May-Grunwald-Giemsa untuk imprint kelenjar getah bening.

Penutup

Dengan mengetahui apa kelebihan dari teknik frozen section dan teknik imprint ini, maka  diharapkan kedua teknik dapat digunakan oleh seorang ahli patologi terutama atas indikasi yang sesuai. Teknik frozen section terutama dipakai untuk mendapatkan diagnosa yang cepat, ketika pasien sedang berada di ruang operasi. Bila dapat dipastikan batas reseksi terhadap tepi keganasan diharapkan tidak akan mengulang kembali operasi pengangkatan tumor tersebut. Dengan demikian akan lebih menghemat biaya penanganan maupun perawatan pasien.

DAFTAR  PUSTAKA

1. Frozen Section Procedure available at http ://en.wikipedia.org/wiki/.
2. Bancroft, J.D., Gamble, M.: Theory and Practice of Histological Techniques, 5^th Ed., Churchill Livingstone, Toronto, USA, 2002,        p.85-107.
3. Methods of  Frozen Section available at  http://www.pathologie-fuerth.de/
4. Frozen Section Technique  available at http://en.wikipedia.org/wiki/.
5. Frozen Section Tecnique available at http: //www. medparse. com/axsop/ axsop 025.htm.
6. Jacob DS, DeMott WR, et al: Frozen Section Biopsy available at http://jama.com/.
7. Zugibe, F.T.: Diagnostic Histochemistry, The C.V. Mosby Company, Saint Louis, USA, 1970, p.3-36.